引言
本研究指出，抗體可變區與恒定區的搭配，分別或共同影響抗體的等電點、熱穩定性、疏水性、粘度、溶解度等關鍵分子特性，最終影響抗體的可開發性。
基于質譜的從頭測序技術，作為抗體開發的重要技術，可以通過獲得抗體的全長氨基酸序列和存在的修飾，助力解析抗體的特性。Rapid Novor快序生物基于血清多抗蛋白的抗體開發技術，可以高效獲得免疫動物血清中優質天然單抗的序列，這些經體內篩選的抗體，可變區與恒定區的適配程度更優，可開發性更高。
簡介
在生物醫藥領域，單克隆抗體（mAbs）已成為對抗腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病及感染性疾病的核心治療手段。盡管人類免疫球蛋白存在五種天然產生的類別(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，但迄今為止，研發階段的重組治療性抗體中絕大多數屬于IgG類—— 在已上市的IgG抗體療法中，約74%以IgG1為基礎，IgG2和IgG4各占約13%。過去，IgG亞型的選擇多聚焦于效應功能，卻常常忽略了亞型差異對抗體“可開發性”的影響，其中一個核心原因在于，對IgG亞型如何影響抗體分子特性缺乏系統認識。由 Syndax Pharmaceuticals 與禮來（Lilly）研究團隊聯合完成的這項研究，揭示了 IgG 亞型對單抗分子特性的調控規律，為藥物開發早期的亞型選擇提供了關鍵實驗依據。
一、抗體的構建與制備：排除干擾，聚焦亞型差異
抗體的可變區序列差異極大，因此想要分析不同IgG亞型對抗體特性的影響，需要排除可變區差異的干擾。為解決這一問題，研究團隊構建了“固定可變區+可變亞型”的12種抗體（表1）。具體來說：
選擇代表性可變區：先選擇3個抗體可變區（Fv A、Fv B、Fv C），它們的電荷、疏水性差異顯著，能覆蓋臨床中常見抗體的特性。比如Fv A帶正電較多、疏水性低，Fv C疏水性則較強。
搭配 4 種核心亞型 / 變體：再將這3個可變區分別與4種常用的IgG亞型/變體（IgG1、IgG1EN、IgG2、IgG4PAA）的恒定區結合。其中，IgG1EN是IgG1的突變體，效應功能減弱；IgG4PAA是IgG4的突變體，能減少免疫反應，增強血清穩定性。
抗體制備與純化：所有抗體都通過CHO細胞表達，并采用標準工藝純化
表1 本研究使用的抗體
二、關鍵發現：IgG亞型對抗體特性的影響規律
研究團隊從等電點、熱穩定性、疏水性、粘度、溶解度等多個核心維度，系統分析了IgG亞型的作用，得出了一系列對抗體開發極具價值的結論。
1. 等電點（pI）：亞型微小影響，可變區主導
等電點是抗體制劑 pH 設計的核心依據 —— 若制劑 pH 接近抗體 pI，易引發分子聚集或沉淀。如表2所示，本研究發現：
亞型的影響：相同可變區下，pI排序為IgG1≈IgG1EN > IgG2 > IgG4PAA，差異幅度0.3-1.0單位。IgG1EN的5個突變僅讓pI輕微降低0.1-0.2個單位，影響極小。
可變區的影響：可變區對pI的影響遠大于亞型。Fv A的抗體pI最高（8.2-9.1），Fv C次之（6.3-7.4），Fv B最低（6.1-7.1），這和可變區的表面電荷分布直接相關 ——Fv A表面以正電為主，Fv B、Fv C則以負電為主。
計算與實測一致性：計算pI與實測pI的趨勢一致，但實測值受三維結構影響（如氨基酸側鏈暴露程度），存在與理論值存在一定差異。
表2 抗體的實測與計算等電點
2. 熱穩定性：亞型影響 CH2 域，可變區決定 Fab 穩定性
熱穩定性直接影響抗體的儲存期限，通常用通過差示掃描量熱法（DSC）檢測解折疊溫度（Tm）評估，Tm越低，抗體越容易在儲存中降解，研究結果（圖1）顯示：
亞型的影響：相同可變區下，不同亞型解折疊起始溫度（Tm-onset）約為60℃。Fab 域 Tm 方面，IgG1 mAbs 與 IgG1EN 相近，且高于或略高于 IgG2，同時高于 IgG4PAA 5。此外，IgG2 mAbs（尤其 IgG2-A）的熱圖譜更復雜，推測與不同的二硫鍵異構體構象有關。
可變區的影響：可變區對整體熱穩定性影響更大。Fab Tm Fv A（80.3-86.0℃）> Fv B（76.0-77.2℃）≈ Fv C（76.4-77.7℃）。
圖1 差示掃描量熱法評估抗體的熱穩定性
3. 疏水性：可變區主導，亞型影響可忽略
疏水性過強的抗體會在高濃度儲存中發生聚集，導致藥效下降或引發免疫反應。研究通過疏水相互作用色譜（HIC）檢測保留時間及疏水相互作用潛力（HIP%），發現（表3）：
疏水性幾乎完全由可變區決定：疏水性排序為 Fv C > Fv A ≈ Fv B，同源建模顯示 Fv C CDR 域疏水性補丁最大，Fv A 最小。
亞型對疏水性的影響極小：同一可變區下，不同亞型的HIP%差異不到3%，僅IgG4PAA略高一點，但這種差異不足以引發聚集風險變化。這意味著，若想改善抗體的疏水性問題，優化可變區遠比更換亞型更有效。
表3疏水相互作用色譜法評估抗體的疏水性
4. 粘度：亞型與可變區共同影響
高濃度制劑對粘度要求嚴苛，粘度過高會增加注射阻力，影響患者體驗和藥物吸收。研究發現，粘度是受“亞型-可變區”共同作用影響最顯著的特性（表4）：
可變區的影響：粘度排序為Fv A（18.4-28.7 cP）> Fv B（9.1-13.4 cP）≈Fv C（9.4-14.9 cP）。
亞型的差異化影響：亞型對粘度的影響依賴于可變區特性（圖3）：
o 搭配 Fv A/B 時：粘度排序為IgG4PAA > IgG1EN > IgG2 ≈ IgG1，推測與 IgG4PAA 的 CH3 域負電補丁增強 “Fv 正電 - Fc 負電” 相互作用有關；
o 搭配 Fv C 時：粘度排序為IgG2 > IgG4PAA ≈ IgG1EN ≈ IgG1，可能因 Fv C 的高疏水性掩蓋了亞型電荷效應，而 IgG2 的二硫鍵異構體引發分子間交聯，導致粘度升高。
特殊現象：IgG2-A 在高濃度儲存中發生顯著沉淀，無法檢測粘度，提示部分IgG2抗體可能存在“高濃度穩定性缺陷”，需在早期開發中提前篩查。
表4 抗體的黏度
5. 溶解度：電荷狀態是核心，亞型影響依賴 pI
溶解度是高濃度制劑的“準入門檻”，溶解度不足會導致抗體沉淀或產生濁度，影響藥效和安全性。本研究采用“PEG誘導沉淀法”和“微濁度法”測試，結果高度一致（圖4-5）：
可變區的主導作用：溶解度排序為Fv A > Fv C > Fv B，Fv A 因高 pI（電荷優勢）溶解度最佳。
亞型的條件下影響：亞型對溶解度的調控依賴抗體整體 pI：在pH6.0的緩沖液中，當pI<7.5 時，排序為IgG1≈IgG1EN > IgG2 > IgG4PAA；pI>7.5（如Fv A）時，亞型差異消失（濁度低于檢測下限）。
圖4 通過PEG誘導沉淀法（a）和微量濁度法（b）評估抗體的溶解度
圖5 抗體等電點與溶液微濁度的相關性
6. 結構解析：從分子層面驗證規律
為解釋實驗現象，研究通過同源建模與表面特性分析，揭示了亞型與可變區調控分子特性的結構基礎（圖6）：
表面電荷分布：
可變區：Fv A 表面以正電為主；Fv B/C 則在 CDR 區存在顯著負電簇；
恒定區：，凈電荷排序為IgG1（16.1）> IgG1EN（14.7）> IgG2（12.3）> IgG4PAA（8.9），IgG4PAA CH3 域末端強負電補丁是其 pI 低、粘度高的關鍵。
疏水補丁分析：
可變區：Fv C 的 CDR 區疏水補丁面積最大，Fv A 最小，Fv B 為 “突出型疏水區域”，解釋了疏水性檢測中“Fv C > Fv B ≈Fv A”的規律。
恒定區：所有IgG亞型的恒定區疏水補丁大小與分布無顯著差異，與HIC結果一致，進一步驗證 “疏水性由可變區主導” 的結論。
圖6 同源建模分析抗體表面電荷和疏水
三、實戰指導：抗體開發如何選亞型？
這份研究的最大價值，在于將基礎研究結論轉化為可落地的開發策略，為抗體藥物早期決策提供重要參考：
1. 優先選IgG1/IgG1EN：兼顧可開發性與靈活性
IgG1具有高溶解度、低粘度、良好熱穩定性的綜合優勢，適合開發高濃度抗體；IgG1EN 能通過突變消除效應功能，避免“非靶免疫激活”，且保留了IgG1的可開發性優勢，但需考慮控制CH2區的穩定性風險。
2. 慎用IgG4PAA：提前評估粘度與溶解度風險
IgG4PAA的使用需注意兩點：一是若搭配 Fv A、Fv B 這類高正電可變區，容易因“Fv 正電-Fc 負電”相互作用導致高粘度；二是其低pI可能導致溶解度不足，可能在制劑方面需要多做優化。
3. 早期開展 “亞型 - 可變區” 組合篩查
鑒于亞型與可變區的“互動效應”（如Fv C 搭配IgG2 時粘度異常），應在早期篩選階段就構建“同一 Fv + 多亞型” 的抗體庫，同步pI（cIEF）、粘度（125 mg/mL）、溶解度（微濁度法）、熱穩定性（DSC）等核心指標，找到治療效應和可開發性間的平衡點。
結語
IgG 亞型的選擇，看似是抗體開發早期的一個技術細節，卻直接影響制劑開發難度、儲存穩定性及臨床給藥方案的可行性。這份研究通過“固定可變區”的設計，揭示了 IgG 亞型的對抗體可開發性的關鍵調控作用，為抗體工程技術的發展、和更合優抗體藥物的設計提供了重要指導。
參考文獻
Tang, Y., Cain, P., Anguiano, V., Shih, J. J., Chai, Q., & Feng, Y. (2021). Impact of IgG subclass on molecular properties of monoclonal antibodies. mAbs, 13(1), 1993768. https://doi.org/10.1080/19420862.2021.1993768
